Purificacion proteinas actividad específica
La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas en función de su carga neta. Una disminución inesperada de la actividad específica puede indicar degradación de la proteína. Sin embargo, SDS-PAGE no proporciona información directa sobre la actividad específica.
La espectrometría de masas también puede identificar modificaciones postraduccionales. La diálisis se realiza utilizando una membrana semipermeable que permite el paso de moléculas pequeñas como la sal. Los cristales se pueden utilizar para determinar la estructura tridimensional de la proteína mediante difracción de rayos X.
La cristalización a menudo requiere una proteína con alta actividad específica. El diseño de vectores de expresión optimizados puede facilitar la purificación de proteínas. La proteína de interés se une a la resina y luego se eluye mediante un gradiente de sal.
La proteína permanece en el interior de la membrana, mientras que la sal se difunde hacia el exterior. Un valor alto de actividad específica indica que la proteína purificada es altamente activa y tiene poca contaminación. La presencia de inhibidores de proteasas puede prevenir la proteólisis.
Es necesario combinar la SDS-PAGE con ensayos de actividad enzimática.
Optimizar las condiciones de ensayo es crucial para obtener resultados precisos. La electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) permite evaluar la pureza de la proteína purificada. Los factores que pueden afectar la actividad específica incluyen la temperatura, el pH y la presencia de inhibidores.
La ultracentrifugación puede utilizarse para separar proteínas en función de su tamaño y forma. Esta técnica utiliza una matriz unida a un ligando que se une específicamente a la proteína de interés. Las proteínas más grandes sedimentan más rápidamente que las proteínas más pequeñas.
Sin embargo, la ultracentrifugación no suele ser la técnica más efectiva para mejorar la actividad específica por sí sola. Esto restaura la actividad óptima de la proteína. Se utilizan resinas con cargas positivas (intercambio aniónico) o negativas (intercambio catiónico).
La actividad específica es un indicador de la pureza de la proteína, representando la actividad enzimática por unidad de masa.
La purificación de proteínas busca aislar una proteína específica del resto de componentes celulares
Métodos espectrofotométricos y cromatográficos son comúnmente usados para cuantificar la proteína. Un control riguroso de estos factores garantiza la reproducibilidad de los resultados. Determinar la actividad específica requiere medir tanto la actividad enzimática total como la concentración total de proteína.
La diálisis es un paso importante después de la precipitación con sulfato de amonio para eliminar el exceso de sal. La inclusión de etiquetas de afinidad, como la etiqueta His, permite una purificación rápida y eficiente. La cromatografía de afinidad es una técnica poderosa para la purificación de proteínas con alta actividad específica.